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S0922-9 AAV2/9-PV.Promoter.S5E2-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-pA

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SCN1A编码Nav1.1，这是一种钠通道，在三个不重叠的神经元群体中表达：PV cINs， VIP cINs和第5层锥体神经元。为了找出Scn1a特异表达的调控序列，Jordane Dimidschstein实验室取了靠近该基因转录起始位点的保守位点，并用scATAC-seq(single-cell assay for transposable-accessible chromatin sequencing)技术对阳性表达细胞测序（这种技术可以知道染色质上哪些区域是处于开放的状态，一般只有开放的染色质才能结合转录因子），筛选出E1~E10这10个备选增强子序列。

为了检测候选增强子的特异性，作者将每个候选序列插入到含有红色荧光报告基因(rAAV-E[x]-dTomato)的rAAV骨架中，生产PHP.eB血清型的病毒，全身注射到成年小鼠体内。3周后，病毒在大脑皮层以及多个大脑区域都有很强的表达。除E5外，绝大多数病毒标记的细胞表达Gad1（泛中间神经元标记物）。不同增强子的病毒在皮质神经元中的共定位程度各不相同，从E2的>90%到E6的<5%。接下来，作者进一步研究了E2、E5和E6表达的神经元群体的身份和层次分布。与它们的层级分布一致，与各种标记的共定位分析表明，绝大多数表达dTomato细胞在E2调控元件的控制下与PV共定位。作者还发现E6对VIP中间神经元有很高的选择性。E5调控元件虽然在所有层都有稀疏的表达，但在第5层锥体神经元表达明显更强。

这些数据表明，在大脑皮层表达Scn1a的神经元群体中，很大一部分被这三种增强子的共同表达所反映，而这3种神经元互相并不重叠，因此这些病毒工具提供了一种分析神经元亚型的手段，可以用来研究特定神经元的正常功能以及病变皮层中的异常。

PV cIN神经元是一类重要的快放电的中间神经元，大约占皮层中间神经元的40%。这些神经元对局部神经网络施加很强的抑制性控制，它们的功能障碍直接与神经和精神障碍有关，包括德拉韦氏综合征、局灶性癫痫、自闭症谱系障碍和精神分裂症，因此，控制PV cIN神经元的活动对基础研究和临床应用都特别有意义。

由之前的实验可知，E2调节元件对PV cIN有大约90%的特异性，所以作者将精力集中在研究E2调控元件的特性上，以开发一种具有广泛实用价值的病毒工具。全身注射rAAV-E2-dTomato的成年小鼠在1周后即可检测到病毒报告基因的表达，3周后达到较高且稳定的表达水平。免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)均显示皮质区约90%的病毒标记细胞为PV cINs。虽然病毒表达部位主要局限于皮层，但在与Scn1a表达区域密切对应的其他脑区也观察到了一些阳性细胞，比如初级视觉(V1)皮层、扣带皮质、下丘、海马CA1区和黑质网状部。重要的是，除了在肝脏(可能所有通过AAV系统传递的都会在此有表达)和肺部(Scn1a在低水平表达)中观察到少数细胞外，几乎没有观察到脑外的病毒报告基因表达。这表明，尽管经过系统递送，E2载体可以被用来选择性地靶向不同脑区的PV cINs神经元，在中枢神经系统以外的地方没有明显的非靶向表达。

许多实验范例和临床应用将需要局部注射，而不是全身注射。与全身注射相比，立体定位注射通常会导致每个细胞产生更多的病毒颗粒，这可能会导致非靶向表达，要在这些情况下发挥作用，病毒表达必须保持对PV cINs的高度特异性。为了测试增加病毒载量是否改变了特异性，作者在成年小鼠的皮层局部注射了不同滴度的等量rAAV-E2-dTomato，并在一周后检测了报告基因在PV cINs中的表达。结果表明，虽然较高的滴度增加了报告基因的表达水平，但没有观察到特异性的改变。

在小鼠上，因为PV神经元的出现是在P15之后，也就是出生后15天，所以这个启动子在该时间后可以用。不过即使在P0用该启动子，也可以做到对快放电神经元标记特异性大于50%，之后随着时间延长特异性增强。经测试，这个启动子还可以用在猴子和人的细胞上。

在证明了不同注射方式和不同发育阶段的PV cINs E2定向表达的保真度后，作者随后探索了该载体在研究连通性(使用突触前报告)和活性(使用钙成像)方面的应用。当E2被用来驱动突触素(SYP)-tdTomato融合基因时，报告基因的表达在突触前被限制在PV cINs上，末端沿异构体定位在锥体神经元上。当这个载体被用来驱动GCaMP6f表达时，证明了PV cIN是在胡须刺激下招募的。综上所述，这些结果表明，E2为监测PV cIN生物学的各个方面提供了一种有效的手段。

接下来，作者使用化学或光遗传学方法检查E2是否足以引起活动的功能变化。在成年动物中使用E2来引导PSAM4-5HT3-LC38的表达。从这些动物收集的大脑切片中的PV罐头，当暴露在致动器varenicline中时，当电流钳制在阈值以下时，可以被诱导发射。使用GQ-DREADD39也得到了类似的结果。最后，持续和高频激光刺激PV cINs，在脑片中表达红移的视蛋白C1V1，导致对刺激的放电时间锁定。证明这些神经元的接触导致伴随的局部抑制，病毒标记的PV cINs附近的锥体神经元活动被激光刺激持续中断。

在证明了这种方法在体外的有效性后，作者接下来试图探索通过光遗传刺激PV cIN改变体内兴奋网络的能力；在将rAAV-E2-C1V1局部注射到成年动物的V1皮层后3周，在基线和激光刺激下都进行了感染区域内的记录。根据记录到的神经元的棘波宽度和**放电频率来区分它们的同一性。不出意外，激光刺激提高了抑制性神经元间放电的频率，而抑制了兴奋性神经元的放电。