泰新品|双色eGRASP技术绘制大脑“突触功能地图”

2018年，韩国首尔大学Bong-Kiun Kaang团队在《Science》发表题为 "Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation" 的突破性研究。该研究自主研发了双色增强型GRASP（dual-eGRASP）技术，首次在真实记忆环路中实现了对特定记忆印迹细胞（Engram Cells）间突触连接的可视化、定量化与功能解析，为Hebb的“fire together, wire together”假说提供了最直接的实验证据，将记忆的突触存储机制从理论推向了实证。

一、 背景：理论先行，技术滞后——记忆研究的核心困境

“fire together, wire together” 这则源自Hebb的**假说，是当代学习与记忆理论的基石，其核心思想是突触可塑性。然而，尽管有长时程增强（LTP）等现象的支持，该假说始终缺乏在真实记忆神经环路中的直接证据。

关键瓶颈在于：我们无法从海量的神经元连接中，精准地找出“印迹细胞A”与“印迹细胞B”之间的特定突触，并将其与普通细胞间的连接区分开来。传统技术如同在嘈杂的派对上听不清任何两个人的私语，无法对特定突触进行“精准定位”。

二、 破局：革命性的“突触定位器”——dual-eGRASP技术

为解决这一难题，研究团队对传统的GRASP技术进行了革命性升级，开发了dual-eGRASP。

1. 技术原理：巧妙的“分合”设计

核心思想：将互补的荧光蛋白片段分别表达在突触前和突触后神经元上。只有当这两个神经元形成真正的突触连接时，片段才能在突触间隙重组为完整的荧光蛋白并发光。

关键创新：双色标记：团队通过引入特定的点突变，将系统扩展为青色（Cyan）和黄色（Yellow）双色。这意味着，可以同时用两种颜色标记两路不同的突触前输入，并观察它们如何汇聚到同一批突触后神经元上。

2. 技术优化：从“看得见”到“看得清、看得准”

原始的GRASP信号弱、效率低。eGRASP通过三项关键改造实现了信号增强与精准定位（图1）：

突变增强荧光：在GFP1-10中引入S72A等点突变，大幅提升荧光强度。

促进片段结合：插入SH3结合肽与SH3结构域，作为“分子粘合剂”，主动促进两个荧光片段在突触间隙的高效重组。

精准膜定位：使用神经连接蛋白（Nrxn1/Nlgn1）的跨膜与胞外域序列，确保荧光组件精准锚定在突触膜上，避免弥散。

图1 eGRASP示意图

三、 验证：从体外到体内——dual-eGRASP技术的有效性与普适性

在应用于记忆研究这一复杂场景前，研究团队通过严谨的体外和体内实验，系统地验证了dual-eGRASP技术的特异性、可靠性与强大解析能力。

1. 体外验证：在HEK293T细胞中精准显示“接触界面”

为了在最简单的系统中验证双色标记的特异性，作者将三群HEK293T细胞分别转染：

群1：Cyan pre-eGRASP + mCherry（显红色）

群2：Yellow pre-eGRASP + mCherry（显红色）

群3：Post-eGRASP + IRFP670（显白色）

结果（图3）：共培养后，可以清晰地观察到，只有当表达不同颜色pre-eGRASP的红色细胞与表达post-eGRASP的白色细胞相互接触时，才会在接触面形成青色或黄色的荧光信号。细胞内其他区域则没有荧光。

图3 dual-eGRASP系统在HEK 293T中验证结果

此实验证明了dual-eGRASP系统的高度特异性——荧光信号的产生严格依赖于细胞间的物理接触和正确的蛋白组件配对，排除了非特异性结合的可能，为后续复杂的体内研究奠定了坚实的基础。

2. 体内验证：在复杂神经网络中清晰区分不同的解剖学投射

接下来，团队挑战了一个经典的神经解剖学难题：如何在同一脑区内区分来自不同起源、但在空间上混杂的神经输入？作者选择的研究模型是外侧/内侧内嗅皮层（LEC/MEC）向齿状回（DG）的并行投射。

病毒策略：将Cyan pre-eGRASP注射到LEC，将Yellow pre-eGRASP注射到MEC，在DG区注射Post-eGRASP。

结果（图4）：在DG的分子层，观察到了清晰分离、互不干扰的双色荧光带：青色信号严格分布于LEC投射的外分子层，而黄色信号则精确位于MEC投射的中分子层。

图4 dual-eGRASP实际应用

这一结果表明，dual-eGRASP技术不仅能在细胞层面工作，更能在大脑网络的解剖结构层面，精准无误地解析和区分不同的神经通路。其分辨率和特异性足以应对真实大脑中复杂且交织的投射模式，证明了该技术解决实际生物学问题的强大能力。

四、 发现：记忆，被“刻录”在增强的印迹-印迹突触中

在充分验证技术可靠性后，团队将其应用于核心问题：记忆形成后，印迹细胞之间的连接发生了什么变化？为此，他们设计了精妙的实验来比较四种不同的连接类型。

核心概念说明：

E (Engram)：在记忆形成过程中被激活并参与编码的记忆印迹细胞。N (Non-engram)：在记忆形成过程中未被显著激活的普通细胞。结构分析中的四组突触连接（图5B）：

N-N：CA3非印迹细胞→CA1非印迹细胞

E-N：CA3印迹细胞→CA1非印迹细胞

N-E：CA3非印迹细胞→CA1印迹细胞

E-E：CA3印迹细胞→CA1印迹细胞

图5C中的白色树突（iRFP670）对应CA1的非印迹细胞，其上的青色和黄色斑点表示N-N和E-N；红色树突（myr_mScarlet）对应CA1的印迹细胞，其上的青色和黄色斑点表示N-E和E-E。

1. 结构性增强：印迹细胞间建了更多、更强的“桥梁”

突触密度增加（图5D）：CA3印迹细胞投射到CA1印迹细胞的突触（E-E）密度，显著高于其投射到CA1非印迹细胞（E-N）的密度。这表明印迹细胞在形成记忆后，彼此之间会优先建立更多的物理连接。

树突棘形态增大（图5E）：E-E连接的树突棘头部直径和体积也显著大于N-E连接。更大的棘通常代表更强、更稳定的突触。

图5 CA 3-CA1的突触变化

上述结果直接印证了“fire together, wire together”。记忆的形成，特异性地、选择性地强化了印迹细胞网络内部（E-E）的连接架构，而非简单地增强所有与印迹细胞相关的连接。

2. 功能性强悍：印迹-印迹突触是高效的“通信专线”

功能分析中的四组输入（图6B）：

在电生理实验中，为了更全面地评估功能，分组略有不同，引入了“总输入（T）”的概念：Total input to Non-engram neurons

T-N：CA3总兴奋性输入→CA1非印迹细胞

E-N：CA3印迹细胞输入→CA1非印迹细胞

T-E：CA3总兴奋性输入→CA1印迹细胞

E-E：CA3印迹细胞输入→CA1印迹细胞

（通过使用两种不同波长的光分别激活表达Chronos的“总CA3神经元”和表达ChrimsonR的“CA3印迹细胞”来实现）。

图6 AAV注射方案示意图

通过光遗传学结合电生理记录，团队进一步揭示了这些突触的功能特性。

更高的递质释放概率（图7）：成对脉冲比率（PPR）实验表明，来自CA3印迹细胞的输入（E-N和E-E组）其PPR值显著低于对照组（T-N），意味着它们的突触前末梢释放神经递质的基础概率更高。

(PPR实验是通过连续施加两个紧密间隔的电刺激，并比较第二个刺激引发的EPSC反应幅度（P2）与**个（P1）的比值，来间接反映突触前神经元释放神经递质的概率。如果P2/P1比值低（即P2比P1小很多），说明递质释放概率高，因为**次刺激时大部分囊泡已被释放，第二次可释放的囊泡所剩无几)

更强的突触后响应（图8）：Sr2+替代实验显示，与CA1印迹细胞相连的突触（T-E和E-E组）其微型兴奋性突触后电流（mEPSC）的振幅显著更大。这表明这些突触的突触后膜上聚集了更多的AMPA受体。

（Sr2+能替代细胞外的Ca2+，促使突触前神经元“不同步地”随机释放单个囊泡，从而产生大量可分辨的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。每个mEPSC的振幅大小，可以反映单个突触位置的功能性AMPA受体数量）。

图7 PPR实验结果

图8 Sr2+介导的异步释放实验结果

3. 可塑性饱和：记忆已被“固化”，难以再增强

最有力的证据来自配对长时程增强（pairing LTP）实验（图9）

该经典方法通过将突触前刺激与突触后细胞的人工去极化在时间上精确配对，能够人工诱导出突触强度的持久增强（即LTP）。如果某个突触在记忆形成过程中已经自然发生了强化，那么它再次被人工诱导LTP的能力就会减弱，即出现“饱和”现象。

作者通过配对长时程增强（pairing LTP）实验来检验突触的可塑性潜力。实验发现，在施加LTP诱导协议后，T-N、E-N和T-E组的突触反应都显著增强，而E-E组的反应却始终维持在基线水平附近（图9）。这一结果强烈表明，CA3与CA1印迹细胞之间的突触（E-E）由于在记忆形成中已被充分强化，其可塑性已达到饱和，无法被进一步诱导出LTP；而其他类型的突触则仍保留着较强的强化空间。

图9 pairing LTP实验结果

五、总结与展望：开启神经环路研究的“精准测绘时代”

本研究通过dual-eGRASP这把“金钥匙”，从技术验证、结构观察、功能分析和可塑性检验多个层面，构成了一个完美闭合的证据链，证实了记忆是以记忆印迹细胞之间增强的、功能饱和的突触连接形式存在的。

这项技术的意义远超本研究本身，它为我们提供了一台高精度的“突触显微镜”：

疾病研究：精准描绘抑郁症、自闭症、阿尔茨海默病等脑疾病模型中特异的突触连接异常图谱。

学习与发育：动态追踪在整个学习过程或大脑发育中，神经环路连接的精细变化。

药物研发：为针对特定突触连接的药物，提供前所未有的可视化与功能评价工具。

当然，技术亦有边界：eGRASP不适用于胞体紧邻的神经元，且因荧光蛋白成熟慢、结合不可逆，无法实时追踪突触强度的动态变化。

然而，这无疑标志着一个新时代的开启。正如精确地图的绘制引领了地理大发现，大脑“突触功能地图”的绘制，正将神经科学带入一个能够精细解析环路连接的崭新纪元。

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29700265/

mGRASP应用文章

2025年8月，清华大学苑克鑫课题组在《cell》期刊上发表了一篇题为“VIVIT: Resolving trans-scale volumetric biological architectures via ionic glassy tissue”的研究论文。该研究开发了一种基于玻璃体离子液体溶剂的跨尺度生物结构体积检测(Vitreous Ionic-liquid-based Volumetric Inspection of Trans-scale biostructure，VIVIT)的组织学方法。文中使用到来自Taitool的如下三种产品：

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40795853/

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