泰新品|APEX2“快、准、狠”——电镜成像和邻近标记技术

背景

亚细胞结构的高分辨率成像是理解生命活动底层逻辑的关键，其核心是基于电子显微镜（EM）的技术，利用人工酶催化底物在特定区域形成电子致密沉淀，实现对蛋白质和细胞器的高精度空间成像。与此同时，邻近标记技术（如   工程酶催化生物素标记）可绘制生理环境下蛋白质互作网络和“空间蛋白图谱”。两项技术相辅相成：成像提供纳米级定位，邻近标记揭示蛋白质构成，共同为解析自闭症、帕金森等疾病机制提供分子坐标，支撑精准治疗策略的开发。

简介

APEX2（全称：Enhanced Ascorbate Peroxidase 2）是基于L-抗坏血酸过氧化物酶（APX，NM_001250856）定向突变（K14D/E112K/W41F/A134P）改造而来。APEX2作为一种高效的工程酶，在成像与邻近标记技术中均扮演核心角色。其催化效率极高，标记速度快（约1分钟），且扩散距离短（~20 nm），可实现亚细胞级别的高分辨率成像与精准蛋白质组捕获。相比HRP（难以用于还原性环境）和miniSOG（标记效率低、需光照），APEX2适用于所有亚细胞区域，并具备优良的电镜兼容性。

在邻近标记方面，APEX2克服了BioID系列标记时间长（超18小时）、尺寸大的限制，也避免了TurboID因活性过高导致的过度标记问题。尽管其依赖H₂O₂引起一定细胞毒性，不适用于活体标记，但APEX2仍在空间精准性和时间控制上表现**。它不仅能绘制亚细胞蛋白质互作图谱，还为疾病机制研究和药物靶点发现提供了强有力的技术工具。

应用

APEX2 作为一种高效的工具酶，其“一酶多能”主要凝练为三大赛道：

一、APEX2在电镜成像中的应用

3，3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色标记技术是在过氧化氢（H₂O₂）触发下，APEX2瞬间将DAB氧化成不溶性棕色沉淀物，该沉淀物进一步结合四氧化锇（OsO₄），形成电子密度极高的复合物，该复合物在EM和光镜下均可清晰成像(图1)。

图1 基于APEX2的DAB染色标记作用原理^[2]

2012年，Ting AY^[1]实验室首次开发并应用APEX（APEX2的前身），实现了哺乳动物细胞器及特定蛋白的高分辨率电镜成像，通过将APEX分别融合于钙单向转运蛋白（MCU）的N端和C端，研究证实MCU的两端均位于线粒体基质中，解决了长期以来关于其拓扑朝向的争议，为理解线粒体钙摄取机制奠定了关键基础（图2）。2015年，该实验室进一步采用催化性能更强的APEX2，将其与MCU的钙感应亚基MICU1融合，在HEK细胞中进行高分辨率标记。实验结果显示，APEX2产生的电子致密沉淀特异性地分布于嵴间腔（IMS），而未出现在基质中，从而证明MCU是通过感知胞质钙浓度以调控线粒体钙信号通路（图3）^[2]。

APEX2作为高效的基因编码电镜标记工具，其应用已远超Ting AY实验室的早期工作，被广泛用于多种细胞及生物体系的亚细胞结构与蛋白质高分辨率成像。例如，Joesch M^[3]等人将APEX2表达于特定神经元（如视网膜神经节细胞），精细重构了神经元的形态及其突触连接；Salo^[4]等人利用内质网蛋白Hsp47与APEX融合，标记内质网结构，揭示了其与脂滴膜连接的分子机制；Liu^[5]等则在酵母中以APEX2标记高尔基体，明确了Nvj2p在促进内质网-高尔基体膜连接形成中的作用；Marceau^[6]等将APEX2耦联至登革热病毒复制关键蛋白STT3B，通过DAB沉积直观显示病毒感染期间STT3B聚集于病毒诱导的囊泡周围，阐明其在病毒复制中的定位和行为。

综上所述，APEX2不仅在哺乳动物多种细胞类型和亚细胞区室中实现高精度成像，还广泛应用于病毒、微生物及酵母等多种生物系统，已成为细胞生物学和神经科学领域一项**前景的定位与成像关键技术。

二、APEX2在空间蛋白质组学的应用
       基于APEX2活细胞邻近标记技术是通过与诱饵蛋白融合的工程酶催化生物素底物对附近的蛋白质进行共价标记，然后使用链霉亲和素磁珠选择性富集生物素化的蛋白质，并通过质谱法进行鉴定，从而绘制天然生理环境中的蛋白质相互作用网络（图4）。

图4 基于APEX2的邻近标记技术作用原理^[2]

2016年，APEX2的开发者Ting AY实验室在《Nature Protocols》上详细发表了利用APEX2在活细胞中进行空间特异性蛋白质组图谱构建的实验方案。研究中，作者通过将APEX2与靶向线粒体基质或膜间隙的信号肽融合表达，首先借助电镜验证了融合蛋白在线粒体中的准确定位（图5a）。在蛋白质组捕获方面，表达APEX2的细胞经生物素-苯酚（BP）预处理30分钟后，使用H₂O₂刺激1分钟以诱导局部生物素化标记。随后通过NeutrAvidin-Alexa Fluor荧光偶联物对生物素化蛋白进行染色显示，并利用抗V5抗体对APEX2融合蛋白的表达位置加以验证（图5b）。最后，通过链霉亲和素珠富集生物素化蛋白并结合质谱分析，成功鉴定出线粒体基质蛋白质组（495个蛋白，特异性＞97%）和膜间隙蛋白质组（127个蛋白，特异性＞99%），建立了高特异性、空间分辨的蛋白质组图谱（图5c、d）^[7]。

APEX2邻近标记的应用已从线粒体扩展至多种细胞区室和模式生物。Ting实验室不仅绘制了HEK293T细胞的内质网-质膜接触区域蛋白质组，还完成了果蝇肌肉线粒体等图谱的构建。目前，该方法已成功应用于多种哺乳动物细胞及衣原体、酵母、果蝇等微生物和多细胞生物。

值得注意的是，由于神经系统信号传递具有高度瞬时性，传统互作研究技术（如亲和纯化质谱）难以捕获弱或瞬时的相互作用，而APEX2的高时空分辨率使其在神经科学研究中展现出独特价值。例如，Hobson[8]等通过AAV-DIO-APEX2系统在纹状体轴突中标记并发现约70%的代謝/递质相关蛋白富集于此，为帕金森病的“轴突优先”假说提供了关键分子证据。Dumrongprechachan^[9]团队则通过靶向APEX2至不同亚细胞区域（如细胞核、细胞质或细胞膜），解析了皮质纹状体回路中多刺投射神经元（SPN）的直接与间接通路在亚细胞层面的蛋白质组差异，为轴突生长及神经发育机制提供了重要数据支撑。

三、核酸标记等其他领域的应用
        近期研究进一步拓展了APEX2在核酸标记领域的应用：Tschan^[10]等在biotin-phenol孵育阶段，通过温和去垢剂digitonin短暂处理细胞以提升biotin渗透性，成功在hiPSCs、MCF10A等biotin渗透性差的细胞中，绘制出高分辨率RNA空间定位图谱，拓宽了该技术在干细胞与原代细胞中的应用边界；Zheng^[11]等则将APEX2与核层蛋白B1融合，实现了核层附近DNA基因组图谱的绘制。

总结

综上，基于APEX2的电镜成像与邻近标记技术，在蛋白质组、转录组、基因组学等空间多组学领域表现突出，可呈现原生环境中细胞相互作用的全面视图。整合这些技术获取的多组学数据，能帮助研究人员构建精细分子图谱，捕捉细胞间通讯及细胞内调控网络。这种综合方法在生命科学领域潜力巨大，有望为解析生物生长、发育及疾病相关分子机制提供新方向。

值得注意的是，APEX2技术在应用于某些特殊生物体系或结构时存在明显局限性，可能导致实验失败。例如植物细胞、对H₂O₂高度敏感的哺乳动物原代细胞、细胞壁过厚的微生物、胞质内呈高还原环境的寄生原虫，以及目标区域表面缺乏可标记氨基酸或融合APEX2后可能严重影响蛋白正常功能与定位的特定亚细胞结构。

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参考文献：

[1]Martell JD, Ting AY,et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy.

[2]Lam SS,   Ting AY,et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.

[3]Joesch M, et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy.

[4]Salo VT, et al. Seipin regulates ER-lipid droplet contacts and cargo delivery.

[5]Liu LK, et al. An inducible ER-Golgi tether facilitates ceramide transport to alleviate lipotoxicity.

[6]Marceau CD, et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.

[7]Hung V, Ting AY, et al. Spatially resolved proteomic mapping in living cells with the engineered peroxidase APEX2.

[8]Hobson BD, et al. Subcellular proteomics of dopamine neurons in the mouse brain. Elife.

[9]Dumrongprechachan V, at el. Cell-type and subcellular compartment-specific APEX2 proximity labeling reveals activity-dependent nuclear proteome dynamics in the striatum.

[10]Tschan AB, et al. APEX2 RNA Proximity Labeling in Mammalian Cell Lines With Low Biotin Permeability.

[11]Zheng Y, et al. Identifying Genomic DNA Sequences Near the Nuclear Lamina Using Proximity Biotinylation with Ascorbate Peroxidase.