泰新品|ATLAS新型顺行跨突触示踪工具

背景

神经环路的示踪技术主要有逆行示踪和顺行示踪。从突触前细胞到突触后细胞，即顺行方向。从突触后细胞到突触前细胞，即逆行方向。神经环路的示踪技术对于识别神经元之间的连接关系至关重要。传统的示踪工具（如改良的狂犬病毒）主要用于特定细胞类型进行逆行示踪，而类似的顺行示踪工具相对缺乏。

摘要

2025年5月，美国南加州大学Don B. Arnold实验室在《Nature Methods》期刊上发表了一篇题为“ATLAS: a rationally designed anterograde transsynaptic tracer”的研究论文。该研究开发了一种基于合理设计蛋白质ATLAS的顺行跨单突触示踪工具，从基因确定的神经元进行顺行跨突触追踪。

ATLAS的设计原理是：通过在神经元中表达一种设计蛋白ATLAS，该蛋白包含一个抗体样蛋白AMPA.FingR和一个重组酶。当ATLAS蛋白在突触前神经元中表达时，它会被靶向到突触前囊泡中。在囊泡融合到突触前膜并释放其内容物时，BACE酶会切割ATLAS蛋白，释放出AMPA.FingR-重组酶复合物。该复合物随后会结合到突触后细胞的GluA1受体上，并通过内吞作用进入突触后细胞。最终，重组酶会在突触后细胞核中触发报告基因的表达，从而实现顺行跨突触示踪。

研究人员在体外培养的神经元中测试了ATLAS的功能，观察到ATLAS能够从突触前释放，并在突触后细胞中被内化，最终导致报告基因的表达。也在小鼠模型中验证了ATLAS的顺行跨突触示踪能力。该示踪具有高度的特异性和效率，为神经科学研究提供了一种强大的新工具。

成果介绍

1、ATLAS工作原理示意图

ATLAS蛋白如何实现定向、特异性的顺行跨突触标记？如下图1展示了ATLAS蛋白的表达和作用过程，主要分为以下几个步骤：

①、靶向突触小泡：ATLAS蛋白通过其VAMP2结构域被定位到突触小泡。

②、BACE酶切：在释放前，ATLAS中的BACE切割位点（BACEcs）被内源性BACE酶切割，将AF-Cre部分从VAMP2上释放出来。

③、释放到突触间隙：突触小泡与突触前膜融合，将AF-Cre释放到突触间隙中。

④、结合AMPA受体：AF（AMPA.FingR）部分特异性地结合到突触后神经元的GluA1（AMPA受体）的N端。

⑤、内吞进入突触后细胞：AF-Cre复合物通过内吞作用进入突触后神经元。

⑥、转运至细胞核：AF-Cre被运送到细胞核，Cre重组酶在此激活floxed报告基因（如GFP、mCherry等），从而实现对突触后神经元的遗传标记。

图1

2、ATLAS体内效果验证

为了验证ATLAS 技术在体内特异性实现顺行跨突触标记效果，研究人员在WT小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）中注射AAV8-ATLASCre，在纹状体（Str）注射AAV8-DIO-mCherry，成功标记了mPFC→Str的单向投射。而对照组没有注射ATLAS，仅在Str注射了AAV8-DIO-mCherry病毒，几乎没有mCherry表达。（图2）

图2

也在WT小鼠的初级视觉皮层（V1）注射Lenti-CamKII-Cre和AAV8-DIO-ATLASFLP，在上丘(SC)注射AAV8-fDIO-mCherry，成功标记了V1→SC的单向投射。而对照组没有注射ATLAS，仅注射了对照病毒，在SC中几乎无mCherry信号。（图3）

图3

还在VIPR2-Cre转基因小鼠背外侧膝状体核（dLGN）AAV8-DIO-ATLASFLP，初级视觉皮层（V1）注射AAV8-fDIO-mCherry，成功标记了dLGN→V1的单向投射。而对照组没有注射ATLAS，仅注射了对照病毒，在V1中几乎无 mCherry 信号。（图4）

图4

3、ATLAS通过突触特异性进行

由于ATLAS的摄取依赖于GluA1受体，而这种受体不存在于抑制性突触中，因此如果在抑制性神经元中表达ATLAS，任何跨神经元标记都应该是非突触性的。为了说明ATLAS 技术仅通过突触结构发生，而不介导非突触性跨神经元标记。研究人员根据这一原理在SST-Cre 小鼠的初级视觉皮层（V1）中一起注射AAV8-DIO-ATLASFLP（仅在SST+抑制性神经元中表达）和AAV8-fDIO-mCherry。如果 ATLAS 能通过非突触途径（如细胞外扩散）进入非突触连接的细胞，则应在 V1中出现不与 At（ATLAS 标记）共标的 mCherry+ 细胞。而结果显示在V1中观察到大量 At+ 的抑制性神经元（SST+），几乎所有 mCherry+ 细胞都同时表达At。说明ATLAS 的跨神经元标记严格依赖于突触传递，不会通过非突触途径扩散。（图5）

图5

研究人员还在初级视觉皮层（V1）共感染AAV8-ATLASsnCre和AAV8-BACE-HA病毒，并在背内侧纹状体（DMS）注射AAV8-DIO-mCherry病毒。两周后，又在V1相同区域注射AAV8-DIO-ChR2-GFP病毒，以光激活 V1→DMS 的投射。结果显示100%的mCherry+细胞对光刺激有反应（10/10），表明它们都接收来自 V1 的突触输入。70% 的相邻未标记细胞（7/10）也有反应，说明它们也接收输入，但未被 ATLAS 标记。随机选择的未标记细胞中，只有~40%（7/17）有反应。mCherry+ 细胞的 oEPSC 幅度和总电荷显著大于未标记细胞。说明ATLAS 标记的细胞高度特异性地接收来自表达 ATLAS 的突触前神经元的输入，具有突触特异性。（图6）

图6

4、ATLAS完全顺向且跨单突触

许多顺行跨单突触的标记方法，同时也会介导逆行标记。为确定ATLAS在体内是否会介导逆行性标记，研究人员将AAV8-DIO-ATLASFLP和 Lenti-hsyn-Cre 注射到纹状体（Str），并将 AAV8-fDIO-mCherry 注射到前额叶皮层（mPFC）。mPFC → Str是已知的单向顺向投射。如果ATLAS能逆向传播，则应在 mPFC 中看到 mCherry 标记。实验结果显示尽管 Str 中有大量ATLAS表达（At染色），mPFC中确未见明显的 mCherry 标记，与对照组无显著差异。说明ATLAS不介导逆向标记，是严格顺向的。

为测试ATLAS介导的跨突触标记是跨单突触的，研究人员选择已知的双突触通路：V1→SC（上丘）→PBG（旁二叠体核），将 AAV8-ATLASCre注射到V1中，并将 AAV8-DIO-mCherry注射到SC和PBG中。结果在V1中发现了AT标记，并在SC中发现了大量的跨突触 mCherry 标记，但在PBG中未发现显著高于背景的染色。说明ATLAS只能标记直接下游（单突触）的神经元，无法跨越多突触通路。（图7）

图7

5、ATLAS在活动神经元上标记效果被加强

由ATLAS通过从突触小泡中释放AF-重组酶（AF-recombinase）来介导跨突触标记，因此跨突触标记很可能是活动依赖性的。为了在体内验证跨突触标记的活动依赖性，研究人员将AAV8-ATLASsnCre和AAV8-hHM3Dq-mCherry注射到两只小鼠的前额叶皮层（mPFC），并将 AAV8-DIO-GFP 注射到纹状体（Str）。随后对其中一只小鼠每日腹腔注射氯氮平N-氧化物（CNO），另一只则不注射。一周后，对小鼠进行灌注并进行免疫组织化学分析。发现在注射CNO（CNO+）的小鼠mPFC区域存在大量c-FOS标记，且这些标记与At标记（ATLAS表达位点）共定位。相反，未注射CNO（CNO-）的小鼠mPFC中c-FOS标记极少。此外，在CNO+小鼠中，纹状体（Str）的GFP标记无论在总荧光强度还是标记细胞数量上均有所增加。说明ATLAS介导的跨突触标记在活动神经元上效果被加强。（图8）

图8

6、ATLAS也可以用于大鼠上

为了验证ATLAS技术在大鼠上也可以介导顺行跨单突触标记，研究人员将AAV8-ATLASsnCre和AAV8-BACE-HA注射到大鼠腹侧海马的CA1区，并将AAV8-DIO-tdTomato注射到伏隔核（ACB）。在CA1区观察At染色，并在ACB内观察到大量tdTomato标记的细胞，在下丘脑外侧区（LHA）内也观察到tdTomato标记的轴突。说明ATLAS技术在大鼠上也可以实现顺行跨单突触标记。（图9）

图9

总结

ATLAS技术将重组酶通过突触投递到下一级神经元，具有毒性小，环路特异和只跨单级的优点，而且ATLAS可以实现细胞特异的跨突触，比如DIO-ATLASsnFlp只在Cre阳性的细胞中进行顺标，这是用AAV1或者YFV等载体没有办法做到的。相比AAV1表达Cre的方式，ATLAS毒性更小，而且没有逆标的问题。

目前ATLAS理论上只能标记下游GluA1阳性细胞，而且只能标记下一级的一部分细胞，并且一般需要先在下游注射DIO或者fDIO病毒才能实现跨突触标记。ATLAS与AAV1的顺标原理不同，在不同环路工作效率相比如何尚未可知。而且ATLAS并不是在所有环路都工作，也有风险性。

文章链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40312509/

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