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审DIO
升堂,带犯人! !!
(众衙役(泰小V):威~武~)
DIO,有客户状告你有泄露的问题,你可知罪?
冤枉啊!大人!比起LSL结构,我哪里算得上泄露!
虽然你比LSL泄漏少,但并不能证明你不泄露。不过我倒想了解一下你是如何做到比LSL泄露更少的?
我这个设计中目的基因跟启动子是反向的,载体转录出来的mRNA上不会翻译出目的基因。
也就是没有Cre绝对不会翻转?
大人… 实际上因为Lox序列之间的同源性,质粒在细菌中复制过程中,会有一定的几率发生重组,使得最后抽提得到的质粒中有一定比例(约1/1000)的质粒是已经发生重组的
可以避免吗?据我所知,Stbl3等感受态可以减少重组。
很遗憾,像Lox这种小于50个碱基的序列重组并不是RecA蛋白介导的,所以即使用Stbl3感受态也没办法解决问题。
这个问题虽然是细菌复制造成的,但跟你的结构也有关系,难道没有解决方案?
方法倒是有,可以通过减少配对的Lox序列中的同源性,通常设计中发生重组的是完全一样的34bplxo序列。有一些非对称的Lox对,它们序列不完全相同,但能够发生重组,比如Lox66和Lox71这对。由于它们序列不太相同,重组发生几率会降低。
虽然Lox序列可以做这样的改进,但似乎fDIO或dDIO中用的frt和rox序列还没有这样的互补对。
是的。
如你所说,目的基因跟启动子方向相反,转录出来的mRNA不会表达目的基因。不过目的基因所在链就不会转录mRNA吗?
这......
AAV感染后会转变为双链形式,不同AAV单体间会发生连接,有的是头尾相连,有的是头头相连,这可能会导致串联出现的episome上,在不同AAV上的目的基因和启动子的方向是一致的。
大人英明!Callaway实验室已证明这种方法出现的泄露,比Lox非特异重组造成泄露会更严重。
有解决方案吗?
可采用ATG-OUT的构建方式,将ATG和目的基因的ORF放在Lox序列两侧,也就是如果未发生重组,目的基因不是完整的,即使目的基因所在链有转录发生,也不会翻译出有功能的蛋白。
但如果Lox序列在ATG和阅读框之间,岂不是Lox也会翻译成氨基酸序列?
是的,大人。所以这个方式不太适合表达膜蛋白等分子。
那如果把Lox序列放在内含子中呢?
这是很好的设计,但仍然可能会存在问题。正如您所说,其他AAV上的启动子会转录目的基因,长距离的内含子剪切也是有可能的。
泰大V紧皱的眉头已舒展开,说到:
DIO,本官已基本查清事实真相,念你在大多数条件下能够满足实验所需,准许你为科研继续提供服务。泰小V何在?
在,大人!
现命你开发新版本的DIO载体,解决特殊条件下泄露造成的问题!
领命!!!
下面,我们来领略下新版DIO的魅力吧!
在RCF-tdTomato x PvalbCre(上图)和RCF-tdTomato (下图)初级视皮层注射等量的AAV-nef-DIO-Flp(左图)和AAV-nef-DIO2-Flp(右图)后的脑组织切片图。(图片来自参考文献)
截止目前,泰儿图已经研发出如下几种现货,同时接受DIO2相关病毒的定制,如果有需要,请和当地销售工程师联系。
S0760-DJ | AAV2/DJ-hSyn-DIO2-mNeonGreen-P2A-TVA50-P2A-oG-WPRE-pA |
S0761-DJ | AAV2/DJ-eSyn-DIO2-mRuby3-P2A-hM3D(Gq)-WPRE-pA |
S0762-DJ | AAV2/DJ-eSyn-DIO2-mRuby3-P2A-hM4D(Gi)-WPRE-pA |
S0763-DJ | AAV2/DJ-eSyn-DIO2-mNeonGreen-P2A-TVA50-P2A-oG-WPRE-pA |
参考文献:https://www.pnas.org/content/116/52/27001
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