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S0931-9 AAV2/9-PV.Promoter.E29E2-tdTomato-WPRE-pA

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Looger实验室经过筛选，以Pf622（一种来自于荧光假单胞菌中的GABA结合蛋白）为基础进行改造，在中间插入了荧光报告基团cpSFGFP（它们在iGluSnFR中替代cpGFP提高了表达和光稳定性），N段加了出膜信号mito，C端加了膜锚定信号，在连接肽和GABA结合界面上做了优化。

纯化的iGABASnFR的**∆F/F为2.5，与GABA的解离常数为9µM。它对其他氨基酸没有亲和力，对甘氨酸(500µM)、丙氨酸(830µM)和组氨酸(2.4 mM)的亲和力很低。它对类似的四碳代谢物富马酸、苹果酸、草酰乙酸酯和琥珀酸没有亲和力。Looger实验室做了额外的努力，做出了iGABASnFR.F102G（∆F/F提高到4.5但Kd降低到50μM），iGABASnFR.F102Y.Y137L（∆F/F提高到3.5，Kd降低到70μM）以及其他几个突变版本，并对它们的功能做了验证。

将iGABASnFR变异体克隆到pDisplay中，在HEK细胞中表达，都显示出良好的膜定位。

左：iGABASnFR.F102G

右：iGABASnFR.F102Y.Y137L

同样，在AAV2/1-hSyn-iGABASnFR感染P0新生大鼠海马神经元的原代培养中，iGABASnFR在体外14d显示出良好的膜定位和亮度，但F102G和F102Y.Y137L突变体明显变暗，并显示细胞内积累

左：iGABASnFR.F102G

右：iGABASnFR.F102Y.Y137L

在小鼠麻醉模型中，将AAV2/1-hSyn-iGABASnFR病毒注射在primary visual cortex (V1)，然后给予异氟烷（Isoflurane）麻醉处理。异氟烷这类吸入麻醉药会同时降低皮层谷氨酸和GABA递质的释放，对谷氨酸释放影响更明显，所以总体上降低神经元活动。通过双光子显微镜对150×150×450µm的区域进行观察40分钟，发现给予麻醉剂后，iGABASnFR的信号值降低了大约20%，撤药后逐步回升至基线。在与非GABA结合的阴性对照(R205A)的平行实验中，荧光在观察期内缓慢衰减，麻醉解除后没有恢复。

在体小鼠癫痫模型中，将AAV2/1-hSyn-iGABASnFR(或变体)注射到小鼠V1的第2/3层。皮下注射毛果芸香碱诱导癫痫样活动，持续时间长达60分36秒。发作间歇期与多棘波和ECoG发作交替出现，持续1-2分钟。iGABASnFR荧光显示了与发作间期尖峰时间相符的瞬变。

在定型多峰期间，荧光峰间隔<1s可以用iGABASnFR.F102G(图b)分辨。在持续1分钟的癫痫发作期间，仍然可以看到与低频ECoG成分一致的离散峰值(图c)。在癫痫发作期间荧光逐渐减弱，在癫痫发作之间的心电图静默期间缓慢恢复(图d)。由于这种缓慢的下降在发作间歇期和高峰期未见(图a，b)，不能归因于光漂白。iGABASnFR对pH的变化比较敏感。癫痫发作过程中的细胞外酸化已有大量文献记载，并被认为有助于终止癫痫。虽然这种对荧光变化的描述与GABA的激增和细胞外pH的变化是一致的，但使用GABA不敏感的pH指示器(如pHluorin)或改进的pH不敏感的GABA传感器的进一步实验将有助于区分这两种现象。

iGABASnFR黑色,F102G深灰色

F102Y.Y137L浅灰色

R205A黑白色圆圈,cpSFGFP绿色

斑马鱼小脑中的GABA。作为iGABASnFR在体内的最后一个证明，我们在一个虚构的游泳模型中使用光片成像观察到斑马鱼小脑中的GABA瞬变。在斑马鱼中，虚构的游泳触发GABA能小脑浦肯野细胞的强烈激活。在游泳比赛中，我们观察到含有GABA能浦肯野细胞轴突的小脑神经纤维区发生了明显的荧光变化。这一结果表明，iGABASnFR可以可靠地检测到可能在运动控制中起关键作用的局部GABA传递。

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现货上架时间

2021-5-14

状态

原研现货

血清型

AAV2/9

功能基因

tdTomato

功能基因大类

荧光蛋白